Bradford Protein Ölçümü

Yöntem:
Bir çözeltideki protein içeriğinin saptanması için boya-temelli hızlı ve güvenilir bir ölçümdür. Az sayıda girişim yapıcı madde bulundurmasına rağmen boya değişik saflaştırılımış proteinlerle güçlü etkileşimde bulunur. Bu yüzden ölçüm tam kalitatif değildir. Bu ölçüm çeşitli protein düzeylerine cevap olarak boyadaki ayırıcı renk değişikliği temeline dayanan boya bağlayıcı bir ölçümdür. Zaman kazanma ve sınırlanmış girişim maddesi içermesi açısından Lowry tekniğine üstünlükleri vardır. Bu ölçümün prensibi, asidik çözelti Comassie Brilliant Mavisi protein bağlandığında oluşan 465-595 nm arası maksimum absorbans değişikliği gözlemine dayanır. Bu ölçüm duyarlıdır ve 1.2 mg/ml altındaki protein düzeyleri ölçümü için tasarlanmıştır. Biüret tekniğinden daha düşük düzeyleri düzeyleri ölçer. 0.5 mg/ml altındaki protein düzeylerini elde etme tercih edilebilir.

Bradford yöntemi Protein boya bağlanma prensibini kullanarak mikrogram miktarlarda protein tayini için hızlı duyarlı bir yöntemdir.

Reaktifler:
1. Comassie Brilliant Mavi G-250
2. Ethanol %100 (veya %95)
3. O-Fosforik asit %85

Çözeltiler:
Bradford boyası: Sigma kuruluşundan direkt alınabilir. Hazırlanması daha ucuzdur. Boya ışığa hassastır. Bu yüzden hazırlandıktan sonra etrafını folyo veya kağıtla sarın. 0-5 C’de saklayın.

1 litre Bradford boyası hazırlamak için

1. Basamak- 1 litrelik beaker’de 50 ml %95’lik etanol hazırlanması (eğer %100’lük etanolle başlanırsa)
Final Hacim(50 ml) = Etanol hacmi (47.5 ml) + dH20 hacmi (2.5 ml)

2. Basamak- Coomassie Mavisini %95’lik etanole eklenmesi
%95’lik etanol hacmi (50 ml) + Coomassie Mavi (100 mg)

3.Basamak- Boya dilüsyonu için dH2O (distile su) eklenmesi
%95’lik etanol hacmi + Coomassie Mavi (50 ml) + dH2O (850 ml)

4. Basamak- Dilüe edilmiş boyaya fosforik asit eklenmesi
Dilüe boya hacmi (900 ml) + %85 Fosforik asit (100 ml)

Boya reaktifi için elde edilen son konsantrasyonlar : %0.01 (w/v) Coomassie Brilliant Mavisi G-250; %4.7 (w/v) etanol; %8.5 (w/v) fosforik asit.

Çok Önemli Uyarı: 2 parça P5 (medyum-slow) filtre kağıdı kullanarak filtrele. Filtre kağıdını sık değiştir. Her seferinde boyanın akışı gözlemlenmelidir; eğer partiküllü madde görülürse boya yeniden süzülmelidir.

Örnek Hazırlama: Santrifüjasyon (örneğin 10 dk @ 400 * g) veya filtrasyon ile homojenatlar partiküllü maddeden arındırılmalıdır. Bu işlem büyük çözünmez proteinleri uzaklaştıracaktır.

Çok Önemli Uyarı: Bu ölçüm için dilüsyon faktörü ~200/1 olmalıdır. Daha düşük olur ise (~100/1) ölçüm güvenilirliğini kaybeder. Bu yüzden örneklerin olasılıkla ek dilüsyon ihtiyacı olacaktır. Homojenizasyon yapıcı tampon ile dilüsyon yapılacaktır. Ölçüm, her küvete 40 uL gerektirir, böylece örneklerinizi 200 uL olacak şekilde seyreltin (örnekleri tekrar çalışma ihtimaline karşılık). Seyreltme işlemi sırasında hacmi dilüsyon için dökmeden ? önce homojenatı vorteks kullanarak karıştırma konusunda çok dikkatli olunmalı (Örneğin 100:1 de homojenize ettiyseniz, 100 uL homojenat alın ve 100 uL tampon ekleyin. Sonuçta bu işlem 200:1 lik bir dilüsyon oranı verecektir).

Standart Eğrisi:
a.Standartların seçimi: Eğer 200:1 dilüsyon oranı ile 400*g’de santrifüj edilmiş kas dokusu kullanıyor iseniz elinizde 0.4 mg/mL olacaktır (bu da yaş ağırlık olarak 80 mg protein/g verecektir). Bu yüzden 4 standardı şu şekilde seçin:
1. 1.25 mg/mL
2. 0.625 mg/mL
3. 0.3125 mg/mL
4. 0.1562 mg/mL


b.Standart eğrisi oluşturma:
1.Basamak: Kullanmayı planladığınız tüm küvetlerin içerisine 2.0 mL boya pipetleyin.

2.Basamak: 2.0 mL boya içerisine 40 uL protein standardı ekle. Vorteksle (aşırı köpüklenmeden sakın). 5 ile 60 dk arasında bekle. Optik dansiteyi 595 nm’de oku.

3. Basamak (Kör): 2.0 mL boya içine 40 uL dH20 ekle. Vorteksle (aşırı köpüklenmeden sakın). 5 ile 60 dk arasında bekle. Oprik dansiteyi (OD) 595 nm’de oku.

4. Basamak: Y ekseni üzerindeki bilinen protein düzeyleri ile ve X ekseni üzerindeki optik dansite (OD) değerleri (dH2O çıkartılmış şekilde) ile standart eğrisini oluştur. r değeri 0.98’in üstünde olmalı. Ve eğim 2 ve çevresinde olmalı.

Örnekleri Ölçme:

1. Basamak: 2.0 mL boyanın üzerine 40 uL homojenat ekle. Vorteksle (aşırı köpüklenmeden kaçın). 5 ile 60 dk bekle. Optik dansiteyi 595 nm’de oku. Her örneği ikişer kez ölç (örneği dökmeden önce her seferinde vorteksle).

2.Basamak: 2.0 mL boyanın içine 40 uL Potasyum Fosfat tamponu ekle. Vorteksle (aşırı köpüklenmeden kaçın). 5 ile 60 dk bekle. Optik dansiteyi 595 nm’de oku. Potasyum fosfat tamponunun ortalama optik dansitesini her örnekten çıkar.

Protein Konsantrasyonu Hesaplama:

Eğriye karşı örnek optik dansitelerini oku. Mutlak protein konsantrasyonunu dilüsyon faktörü ile çarp.son birimler mg protein/g kas dokusu şeklindedir. 400 * g devirde 80-100 mg/g kas dokusu bulunmalı.

Bu ölçümün başarısı şu unsurlara bağlıdır:
1. İyi boya yapımı ve kullanımdan önce iyi filtre etmek
2. Örneklerin protein konsantrasyonunun 0.5 mg/mL’den düşük olması
3. Her seferinde pipetlemeden önce örneklerin vortekslenmesi
4. Doğru pipetleme
5. Bradford boyasında örneklerin tekbiçimli inkübasyonu

Comments: (0)